Identificación de los subtipos moleculares y construcción de modelos de riesgo en neuroblastoma.

Jul 11, 2023

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 11790 (2023) Citar este artículo

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La heterogeneidad del neuroblastoma afecta directamente el pronóstico de los pacientes. La individualización del tratamiento del paciente para mejorar el pronóstico es un desafío clínico en esta etapa y el objetivo de este estudio es caracterizar diferentes poblaciones de pacientes. Para lograr esto, se utilizaron genes del ciclo celular relacionados con el sistema inmunológico, identificados en el conjunto de datos GSE45547 utilizando WGCNA, para clasificar casos de múltiples conjuntos de datos (GSE45547, GSE49710, GSE73517, GES120559, E-MTAB-8248 y TARGET) en subgrupos mediante agrupación por consenso. . Se utilizaron ESTIMATES, CIBERSORT y ssGSEA para evaluar el estado inmunológico de los pacientes. Y se construyó un modelo de riesgo de 7 genes basado en genes expresados ​​diferencialmente entre subtipos utilizando randomForestSRC y LASSO. Se utilizó análisis de enriquecimiento para demostrar las características biológicas entre diferentes grupos. Los genes clave se examinaron utilizando randomForest para construir una red neuronal y se validaron. Finalmente, se evaluó la sensibilidad al fármaco en las bases de datos GSCA y CellMiner. Clasificamos a los 1811 pacientes en dos subtipos según los genes del ciclo celular relacionados con el sistema inmunológico. Los dos subtipos (Cluster1 y Cluster2) exhibieron características clínicas, niveles inmunológicos, inestabilidad cromosómica y pronóstico distintos. Se demostraron las mismas diferencias significativas entre los grupos de alto y bajo riesgo. A través de nuestro análisis, identificamos subtipos de neuroblastoma con características únicas y establecimos modelos de riesgo que mejorarán nuestra comprensión de la heterogeneidad del neuroblastoma.

El neuroblastoma, un tumor de origen simpático, es el tumor sólido extracraneal más común en la primera infancia. El neuroblastoma representa del 7 al 8% de las neoplasias malignas infantiles con un curso clínico heterogéneo que va desde la regresión local o espontánea hasta la enfermedad metastásica extensa1. La etiología de la enfermedad es compleja y diversa, con múltiples vías de señalización implicadas. La vía del objetivo de la rapamicina (mTOR) en los mamíferos promueve la supervivencia y la quimiorresistencia de las células del neuroblastoma2. La vía de señalización WNT, por otro lado, aumenta los niveles de MYC en pacientes sin amplificación de MYCN3. Además, la vía de señalización ALK es la principal vía diana del oncogén en casos de neuroblastoma esporádicos y familiares4.

Como todos sabemos, la proliferación irrestricta es una característica común de los tumores malignos y está estrechamente relacionada con la desregulación del ciclo celular5. El ciclo celular es un proceso complejo que contiene cuatro fases: Gap 1 (G1), síntesis de ADN (S), Gap 2 (G2) y mitosis (M). Las proteínas del ciclo celular y las quinasas dependientes de proteínas del ciclo celular (CDK) regulan la progresión de las fases del ciclo celular6. Al mismo tiempo, si cada evento del ciclo celular se completa, correctamente o no, está sujeto a un mecanismo de monitoreo de puntos de control celular7. La respuesta al daño del ADN y el punto de control del huso mitótico juegan un papel clave en el mantenimiento de la salud del organismo. Como se sabe, el supresor de tumores p53 participa en múltiples puntos de control del ciclo celular8. Y las anomalías en p53 pueden provocar el desarrollo y la progresión del cáncer a través de múltiples vías9.

Las anomalías en los mecanismos relacionados con el ciclo celular también desempeñan un papel importante en la aparición y desarrollo del neuroblastoma. Se detectó un aumento del número de copias de MYCN en el 25% de los pacientes con neuroblastoma10, lo que se asoció fuertemente con un pronóstico clínico desfavorable11. Mientras tanto, MYCN puede acelerar la proliferación celular12, que puede estar relacionada con la quinasa 4 dependiente de proteínas del ciclo celular (CDK4)13. Para los pacientes con neuroblastoma sin amplificación de MYCN, es más probable que presenten alteraciones cromosómicas y nuevamente conduce a resultados de mal pronóstico14. Esto puede estar relacionado con la ausencia de una región común que codifique una serie de proteínas que desempeñan un papel en la respuesta al daño del ADN (DDR)15. A medida que la investigación se profundiza, la inestabilidad cromosómica juega un papel importante en el desarrollo y progresión de la enfermedad16. Un estudio encontró que la pérdida desequilibrada de heterocigosidad (LOH) en el cromosoma 11q y LOH en el cromosoma 1p36 son factores de riesgo independientes de mal pronóstico en pacientes con neuroblastoma17. La ganancia de 17q también se asoció con una peor supervivencia general (SG)14. También se ha observado inestabilidad cromosómica durante la embriogénesis humana temprana18. Sin embargo, el mecanismo subyacente garantiza que el ciclo celular se desarrolle correctamente. Por lo tanto, comprender los mecanismos implicados en el ciclo celular es crucial para comprender el neuroblastoma.

Diversas etiologías conducen a la variabilidad entre pacientes individuales. La heterogeneidad de los pacientes plantea un gran desafío para el tratamiento individualizado. Para evaluar a los pacientes y estratificarlos para guiar el tratamiento, se han propuesto y aplicado métodos de clasificación basados ​​en múltiples indicadores biológicos. El estadio, la edad, la categoría histológica, el grado de diferenciación tumoral, el estado del oncogén MYCN, el estado del cromosoma 11q y la ploidía del ADN se utilizaron como base de clasificación para el Sistema de Estadificación del Grupo Internacional de Riesgo de Neuroblastoma19. Las aberraciones cromosómicas segmentarias (SCA) también se han estudiado como biomarcador genómico adicional en combinación con la estadificación del INSS para guiar el tratamiento20. Basado en el concepto de tratamiento estratificado, el pronóstico de los pacientes con neuroblastoma está mejorando gradualmente. En las últimas décadas, la tasa de supervivencia a 5 años de los pacientes con neuroblastoma metastásico ha aumentado de menos del 20% a más del 50% mediante una combinación de terapias que incluyen inmunoterapia, terapia con células madre, etc. Aunque esta estadificación desempeña un papel en la evaluación de los pacientes y guiar el tratamiento, el uso clínico es algo limitado. Con el desarrollo de la tecnología de chips genéticos, es una cuestión urgente cómo estratificar a los pacientes a nivel genético para guiar la terapia dirigida.

Dado el papel de las anomalías del ciclo celular en la patogénesis del neuroblastoma, es esencial comprender las causas de la inestabilidad cromosómica (CIN) en el neuroblastoma y estudiar la segregación de cromosomas y centrosomas, la maquinaria del huso y la reparación del ADN1. Esto facilita la exploración del tratamiento individualizado de pacientes con neuroblastoma con fármacos dirigidos al ciclo celular. El objetivo de nuestro estudio es explorar la subtipificación molecular en pacientes con tumores mediante el análisis de los niveles de expresión génica del ciclo celular para refinar aún más el manejo individualizado de la estratificación de los pacientes. Se utilizarán subtipos moleculares y puntuaciones de riesgo para guiar el tratamiento individualizado del paciente y así mejorar el pronóstico del paciente.

Primero, el algoritmo t-SNE clasificó a los 643 pacientes en GSE45547 en diferentes regiones según los niveles de expresión genética, lo que indica heterogeneidad entre los pacientes. Este resultado sugirió que la enfermedad se puede subdividir en subtipos moleculares (Fig. 1A). Teniendo en cuenta la estrecha correlación de la enfermedad con el ciclo celular y la inmunidad, para evaluar el nivel de infiltración de células inmunes y estromales involucradas en el microambiente tumoral (TME) de GSE45547, se aplicó el algoritmo ESTIMATE basado en datos transcriptómicos de 643 muestras. Los resultados también se incorporaron al algoritmo WGCNA como información clínica en la búsqueda de genes del ciclo celular relacionados con el sistema inmunológico (Figura complementaria S1A). Posteriormente, WGCNA obtuvo la red de coexpresión sin escala de 1740 expresiones de genes del ciclo celular de 643 muestras con resultados de inmunización (Fig. 1B). Se generaron dos módulos genéticos con una potencia de 4 como umbral suave óptimo (Fig. 1C). Entre estos módulos, el módulo turquesa exhibió la correlación más alta con el resultado de ESTIMATE y fue considerado como “módulo de genes del ciclo celular relacionados con el sistema inmunológico (IRCCG)”. Y había 924 genes en el módulo turquesa (una lista detallada de genes podría estar disponible en el Material complementario). Exploramos más a fondo la función de los IRCCG mediante análisis de enriquecimiento. Los resultados del enriquecimiento de KEGG para IRCCG mostraron vínculos con vías tanto inmunes como relacionadas con el ciclo celular (Fig. 1D). Los resultados enriquecidos en Biological Process mostraron que estaban involucradas la regulación del ciclo celular y la división nuclear (Fig. 1E). Los productos genéticos de los IRCCG desempeñan un papel en el huso y la región cromosómica (Fig. 1F). Para el enriquecimiento de la función molecular, los resultados mostraron que estaban involucradas vías como la unión de tubulina y la unión de microtúbulos (Fig. 1G).

Identificación y análisis funcional de IRCCG. (A) Los resultados del algoritmo t-SNE muestran heterogeneidad en los pacientes. (B) Análisis de la topología de la red para varios poderes de umbral suave. El panel izquierdo muestra el índice de ajuste sin escala en función del poder de umbral suave. El panel derecho muestra la conectividad media en función de la potencia de umbral suave. Basándonos en un índice de ajuste sin escala superior a 0,9, elegimos 4 como poder de umbral suave. (C) En la parte superior está el dendrograma agrupado de genes con colores de módulo asignados. En la parte inferior están las asociaciones módulo-rasgo. Cada celda contiene la correlación correspondiente y el valor P. Cuanto más oscuro sea el color de la celda, mayor será la correlación. (D) Resultados del enriquecimiento KEGG. Los números en el gráfico indicaron los recuentos de la vía. (E) Resultados del enriquecimiento del proceso biológico. La línea entre puntos indicó la presencia de genes idénticos entre vías. (F) Se demostraron las 5 vías principales de enriquecimiento de componentes celulares. La longitud de la barra amarilla indicó el número de genes de la vía. La altura de la barra azul indica el número de genes que se cruzan. (G) Los primeros 5 enriquecidos con términos de función molecular y los genes en los términos. (H,I) Análisis de componentes principales (PCA) de la expresión génica en conjuntos de datos. La visualización de los pacientes mediante diagramas de dispersión se basó en los dos perfiles superiores de expresión génica con la eliminación del efecto por lotes.

Para que los resultados del estudio sean más objetivos y generalizables, se integraron para el análisis los datos GSE45547, GSE49710, GSE73517, GSE120559, E-MTAB-8248 y GDC TARGET-NBL. En total, se detectaron conjuntamente 16.978 genes de 1.811 pacientes. Antes de la eliminación del efecto de lote, el resultado del análisis de componentes principales (PCA) mostró que las muestras estaban agrupadas por lotes (Figura complementaria S1B). Por el contrario, los resultados después del procesamiento de datos muestran que la normalización multiplataforma ha logrado eliminar los efectos por lotes (Fig. 1H). En los datos normalizados, la intersección de 16.978 genes con genes del ciclo celular relacionados con el sistema inmunológico fue de 913 genes. En total, 11 genes de 924 IRCCG no se incluyeron en el análisis de seguimiento. Esto se debió al hecho de que diferentes microarrays tienen diferentes sondas y se seleccionaron genes comunes para el análisis combinado. Teniendo en cuenta que todos los datos de microarrays provenían de la misma plataforma, los cinco conjuntos de datos de microarrays se normalizaron y se incluyeron en el estudio posterior en su conjunto (Figura complementaria S1C, Figura 1I).

Según la matriz de expresión después de eliminar el efecto del lote de 913 IRCCG, los 6 conjuntos de datos (n = 1811) se dividieron en dos grupos distintos del ciclo celular mediante agrupación por consenso (Fig. 2A), un método de agrupación no supervisado con un valor k de 2 ( Figura complementaria S2A – C). Hubo 871 pacientes en el Grupo I y 940 pacientes en el Grupo II. Además, la puntuación de consenso del grupo para cada subgrupo fue superior a 0,8 sólo en la clasificación de dos subgrupos (Fig. 2B), lo que sugirió que la clasificación con dos subgrupos era más sólida que otras.

Identificación de subtipos y correlaciones clínicas de subtipos. (A) Mapa de calor de matriz de consenso con recuento de grupos de 2. (B) Los diagramas de barras representan las puntuaciones de consenso para los subgrupos y elegimos los resultados con puntuaciones de consenso superiores a 0,8. (C) Mapa de calor de los 50 niveles principales de genes del ciclo celular relacionados con el sistema inmunológico y distribución de edad, estado de MYCN y etapa INSS en los dos grupos. (D) El diagrama de Sankey que muestra si TERT fue una reorganización y si existía APB. (E) El gráfico de barras mostró la distribución de anomalías cromosómicas en los dos grupos. (F) Las curvas de Kaplan-Meier mostraron el tiempo de SG de los dos grupos de pacientes dentro de los conjuntos de datos E-MTAB-8248 y TARGET.

Para comprender las diferencias entre los grupos, se utilizó la información clínica del conjunto de datos para explorar las características de cada uno de los dos grupos. El mapa de calor muestra la agrupación en relación con la edad, las etapas del Sistema Internacional de Estadificación del Neuroblastoma (INSS) y el estado de MYCN, junto con la expresión de los genes utilizados para la agrupación en 1811 pacientes (Fig. 2C). Los genes que se muestran en el mapa de calor fueron los 50 genes principales con la mayor desviación media absoluta de la expresión genética. Un análisis estadístico adicional de la información clínica de los dos grupos reveló que la edad del Grupo 2 era menor que la del Grupo 1 (P <0,05). Los resultados estadísticos detallados se muestran en la Tabla 1 a continuación. Mientras tanto, el estado de MYCN de los pacientes en el Grupo 1 se amplificó principalmente, mientras que el estado de MYCN de los pacientes en el Grupo 2 no se amplificó (P <0,05). El estadio INSS, que está estrechamente relacionado con el pronóstico, también fue significativamente diferente en el Grupo 1 y el Grupo 2 (P <0,05). El alargamiento alternativo de los telómeros (ALT) está regulado por la replicación inducida por rotura. Un diagrama de Sankey muestra el flujo desde los dos grupos del ciclo celular a diferentes estados de la telomerasa transcriptasa inversa (TERT) y los cuerpos de leucemia promielocítica asociada a ALT (APB) en los conjuntos de datos E-MTAB-8248 y GSE120559, en los que el ancho del caudal es proporcional al número de pacientes (Fig. 2D). Para el estado de la transcriptasa inversa de la telomerasa, los reordenamientos de TERT fueron más predominantes en el Grupo 1 (P <0,05), mientras que si se detectaron o no cuerpos de leucemia promielocítica asociada a ALT no difirió directamente en los dos grupos (P > 0,05). El gráfico de barras mostró las tres anomalías cromosómicas estrechamente asociadas con el pronóstico en el conjunto de datos GSE73517: eliminación de 1p, eliminación de 11q y ganancia de 17q (Fig. 2E). Como se muestra dentro de la Tabla estadística 1, la proporción respectiva de eliminación de 1p y ganancia de 17q con respecto al número total de grupos difirió en los dos grupos (P <0,05). Sin embargo, las cantidades de deleción 11q no difirieron entre los dos grupos (P > 0,05). Utilizando datos de supervivencia de E-MTAB-8248 y GDC TARGET-NBL, se compararon las diferencias en el pronóstico entre los dos grupos. Los resultados mostraron que el estado pronóstico del Grupo 2 fue mejor que el del Grupo 1, lo que fue consistente con la distribución de indicadores de pronóstico clínico entre los dos grupos (Fig. 2F).

El microambiente inmunológico está estrechamente relacionado con los tumores y la expresión de los puntos de control inmunológico es un reflejo de la respuesta inmune. Entre los cinco conjuntos de datos de microarrays integrados, se seleccionaron 24 puntos de control inmunológico para compararlos entre grupos. Como lo demuestran los resultados, a excepción de LAG3, CD276 y CD86, los niveles de puntos de control inmunológico fueron más altos en el Grupo 2 que en el Grupo 1 (Fig. 3A). En base a lo cual se utilizó CIBERSORT para estimar la infiltración inmune y se usó un gráfico de barras para mostrar el porcentaje de células inmunes en cada paciente (Fig. 3B). Para comparar la variabilidad de la inmunización entre grupos en GSE45547, se realizó un análisis para comparar las diferencias entre los dos grupos de células inmunes según la agrupación. Los resultados indican una variabilidad significativa en las células inmunes de los dos grupos (Fig. 3C). Una cuantificación adicional de las células inmunitarias utilizando ssGSEA muestra que el grupo 2 tiene más células inmunitarias en general que el grupo 1 (Fig. 3D). En los otros cinco conjuntos de datos, utilizando nuevamente los resultados de CIBERSORT y los resultados de ssGSEA comparados entre los dos grupos, el Grupo 2 mostró más infiltración inmune (Figura complementaria S3A-E).

Comparación de la inmunización de dos subtipos agrupados. (A) Los diagramas de caja mostraron la expresión de ARNm de puntos de control inmunes en dos grupos (*P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001). (B) El gráfico de barras apiladas mostró el porcentaje de células inmunitarias en 1811 pacientes. (C) Se utilizaron diagramas de caja para mostrar la distribución de las proporciones celulares calculadas por el algoritmo CIBERSORT de células inmunes entre los dos grupos (*P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001). (D) Diagrama de caja de la distribución de la expresión de células inmunes entre los dos grupos calculada por el algoritmo ssGSEA (*P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001). (E – J) Se crearon diagramas de caja para visualizar la distribución de la puntuación estromal, la puntuación inmune, la puntuación ESTIMATES y la pureza del tumor, que se calcularon mediante el algoritmo ESTIMATE entre los dos grupos en GSE45547 (E), GSE49710 (F). , conjuntos de datos GSE73517 (G), GSE120559 (H), E-MTAB-828 (I) y TARGET (J).

El estado inmunológico de los pacientes se evaluó adicionalmente dentro de los seis conjuntos de datos utilizando el algoritmo ESTIMATE. Los resultados del análisis muestran una pureza tumoral más alta en el grupo 1 que en el grupo 2 en el conjunto de datos GSE45547 (P <0,05). Relativamente, la puntuación estromal, la puntuación inmune y la puntuación ESTIMATE en el grupo 1 fueron más bajas que en el grupo 2 (P <0,05) (Fig. 3E). El mismo análisis se validó para los otros cinco conjuntos de datos (Fig. 3F-J). Combinando los resultados del análisis anterior, creemos que el Grupo 2 pertenece a la clase de estado inmunológico rico y el Grupo 1 es la clase de estado inmunológico pobre.

Para investigar en profundidad los genes clave que causan las diferencias entre los grupos, se obtuvo un total de 4945 genes diferenciales utilizando el paquete "DESeq" en los datos TARGET entre los dos grupos, de los cuales 1022 eran genes altamente expresados ​​en el Grupo 1 en relación con el Grupo 2 y 3923 eran genes de baja expresión (Fig. 4A) (Fig. Suplementaria S4A). El análisis de varianza de los cinco conjuntos de datos normalizados utilizando el paquete "limma" arrojó 238 genes de varianza. Hubo 161 genes regulados positivamente y 77 genes regulados negativamente (Cluster1 VS Cluster2) en el resultado (Fig. 4B). Un total de 206 genes que se cruzan de los dos análisis de diferencias se designaron como genes de diferencia intergrupal para los Grupos 1 y 2 (Fig. 4C). Luego construimos una red de interacción proteína-proteína (PPI) utilizando la base de datos STRING (Figura complementaria S4B). Los 30 genes TOP basados ​​en el algoritmo MCC se demostraron adicionalmente utilizando el complemento cytoHubba en Cytoscape (Fig. 4D).

Identificación de DEG y anotación funcional de DEG. (A) El gráfico de volcán representó la distribución de DEG en el conjunto de datos TARGET (Cluster1 VS Cluster2) y etiquetó los 5 genes principales con la clasificación más pequeña según el valor de P ajustado. (Los genes con valor de P ajustado > 0,05 no se mostraron en el gráfico). (B) Mapa de calor de los DEG derivados de los 5 conjuntos de datos de microarrays. (C) El diagrama de Ven mostró el número de genes que se cruzan en los resultados del análisis de diferencias. (D) Los 30 genes TOP basados ​​en el algoritmo MCC, con los colores más oscuros, que indican las puntuaciones más altas de MCC. (E,F) El gráfico de barras (E) mostró los resultados del enriquecimiento GO y los gráficos de burbujas (F) mostraron los resultados del enriquecimiento KEGG para el Grupo 1 en relación con los genes altamente expresados ​​del Grupo 2. Los números en el gráfico de barras representaban los recuentos en el camino. (G, H) El gráfico de barras (G) mostró los resultados del enriquecimiento GO y los gráficos de burbujas (H) mostraron los resultados del enriquecimiento KEGG para el Grupo 1 en relación con los genes de baja expresión del Grupo 2. Los números en el gráfico de barras representaban los recuentos en el camino. En los resultados de enriquecimiento de GO (E,G), BP se refiere al proceso biológico, CC denota componente celular y MF representa función molecular.

Para conocer mejor la función de los genes diferenciales, se realizó un análisis de enriquecimiento. Para los genes altamente expresados ​​(Cluster1 VS Cluster2) entre los dos grupos, los resultados del enriquecimiento de GO mostraron que estos genes estaban estrechamente asociados con la progresión del ciclo celular (Fig. 4E). Los 5 términos TOP en Procesos Biológicos fueron segregación cromosómica, división nuclear mitótica, división nuclear, fisión de orgánulos y segregación de cromátidas hermanas. Los resultados del Componente Celular estuvieron involucrados principalmente en la región cromosómica; cromosoma, región centromérica; cromosoma condensado; cromosoma condensado, región centromérica y huso. Unión de microtúbulos; unión de tubulina; actividad motora de microtúbulos; actividad catalítica (que actúa sobre el ADN) y actividad motora citoesquelética fueron los 5 términos TOP en Función Molecular. El análisis de KEGG sugirió que los genes altamente expresados ​​(Cluster1 VS Cluster2) estaban asociados principalmente con el ciclo celular, la replicación del ADN, la meiosis de los ovocitos y otras vías estrechamente relacionadas con el ciclo celular (Fig. 4F).

Los resultados del enriquecimiento de genes de baja expresión mostraron una asociación con la inmunidad. Los resultados del enriquecimiento de GO incluyen principalmente el procesamiento de antígenos y la presentación de antígenos peptídicos exógenos a través de la unión del complejo proteico MHC clase II y MHC clase II (Fig. 4G). De manera similar, los resultados del enriquecimiento con KEGG estuvieron estrechamente relacionados con la inmunidad (Fig. 4H). En general, los análisis de enriquecimiento mostraron que los DEG no sólo desempeñan un papel importante en la división del cromosoma sino que también están asociados con la reparación del ADN y la inmunidad. Al mismo tiempo, los resultados del enriquecimiento de cada uno de los dos grupos DEG correspondieron a los resultados de los análisis clínicos e inmunológicos anteriores.

Con base en los resultados del enriquecimiento, que implican que los DEG estaban fuertemente asociados con la inestabilidad cromosómica y la heterogeneidad de la enfermedad en los pacientes, decidimos buscar genes clave dentro de los DEG para construir un modelo de riesgo. En primer lugar, seleccionamos preliminarmente 177 genes relacionados con el sistema operativo con un umbral de filtrado de un valor de P inferior a 0,01 mediante un análisis de regresión de Cox univariante en el conjunto de datos E-MTAB-8248 (Tabla complementaria 1) y mostramos sus 10 genes más importantes según el mapa forestal (Fig. .5A). En el siguiente paso, se utilizó el paquete "randomForestSRC" para filtrar las variables clave. Como se muestra en la Fig. 5B, la tasa de error OOB tiende a estabilizarse cuando el árbol es > 200, mientras que la importancia de las variables se juzgó utilizando el algoritmo de Importancia Variable (VIMP) y las barras azules más largas indican las variables más importantes (Fig. 5B). . Seleccionamos los 50 genes más importantes según VIMP para incluirlos en el modelo de regresión LASSO Cox (Figura complementaria S5A). Con un valor de λ óptimo (Fig. 5C, D), 7 genes (NMU, E2F3, UBE2S, DHFR, MIA, CHD5 y FAXDC2) conservaron sus coeficientes de Cox individuales después de la regularización de LASSO (Tabla complementaria 2). Utilizando la fórmula establecida, se calculó la puntuación de riesgo para cada muestra (Fig. 5E). Con un mejor valor de corte (Figura complementaria S5B), el conjunto de datos se dividió en grupos de bajo y alto riesgo (Figura 5F). El análisis de Kaplan-Meier demostró que los pacientes con una puntuación de riesgo más alta exhibieron peor supervivencia libre de progresión (SSP) y SG en el conjunto de datos E-MTAB-8248 (Fig. 5G, H).

Construcción del modelo de riesgo. (A) El diagrama de bosque mostró el HR y el intervalo de confianza del 95% de los 10 genes TOP más significativos en los resultados de regresión univariada, ordenados por valor de P. (B) El gráfico de la izquierda mostró la variación de la tasa de error con el número de árboles. El gráfico de la derecha mostró la clasificación de genes según la importancia del algoritmo VIMP, donde el azul representa favorable al juicio correcto de las terminaciones y el rojo representa desfavorable. (C) Cada línea en el gráfico anterior representaba un gen, la coordenada vertical era el valor del coeficiente, la coordenada horizontal inferior era log(λ) y la coordenada horizontal superior era el número de coeficientes distintos de cero en el modelo en esta vez. (D) Según la validación cruzada, para cada valor de λ, alrededor del valor medio de la covariable objetivo que se muestra en rojo, podemos obtener un intervalo de confianza para la covariable objetivo. Las dos líneas discontinuas indican cada uno de los dos valores particulares de λ. Elegimos lambda.1se como parámetro final del modelo. (E) Cada punto en el diagrama de dispersión representaba el estado de supervivencia y el tiempo de supervivencia de un paciente. Las coordenadas horizontales fueron los pacientes clasificados de menor a mayor según sus puntuaciones de riesgo. (F) Según la puntuación de riesgo de cada punto en el diagrama de dispersión que representa a un paciente, los dividimos en grupos de alto y bajo riesgo. (G,H) Las curvas de Kaplan-Meier mostraron el tiempo de supervivencia libre de progresión (G) y el tiempo de SG (H) de los dos grupos de riesgo de pacientes dentro del conjunto de datos E-MTAB-8248.

Primero, se compararon las curvas de características operativas del receptor (ROC) de los indicadores clínicos relacionados con el pronóstico dentro del conjunto de datos E-MTAB-8248, y todas las puntuaciones de riesgo fueron mejores que estos indicadores (Fig. 6A). Además, el análisis de la curva ROC indicó que los valores del área bajo la curva (AUC) de la firma de OS en 1, 3 y 5 años fueron 0,9527, 0,87266 y 0,8792, lo que indica que nuestras firmas de pronóstico tienen una discriminación favorable (Fig. 6B). Mientras tanto, en el conjunto de datos GDC TARGT-NBL, las puntuaciones de riesgo también estaban fuertemente correlacionadas con la SG (Fig. 6C). Además, analizamos y mapeamos los perfiles de expresión de siete genes en diferentes subgrupos de riesgo de 1670 pacientes, y se pudieron observar diferencias de expresión significativas (Fig. 6D). Además, comparamos la distribución de las siete expresiones genéticas en una variedad de tumores. Se descubrió que UBE2S estaba altamente expresado en la mayoría de los tejidos tumorales, mientras que MIA se concentraba principalmente en tejidos tumorales de melanoma (SKCM) (Figura complementaria S6A). Las mutaciones de los siete genes se exploraron más a fondo en una variedad de tumores y se pudo encontrar que la tasa de mutación más alta fue CHD5, seguida de E2F3. Y los tipos de mutaciones se concentraron principalmente en amplificación, eliminación profunda y mutación sin sentido (Fig. 6E).

Validación e investigación de modelos de riesgo. (A) La capacidad de los indicadores clínicos y las puntuaciones de riesgo para determinar el pronóstico en el año 1, el año 3 y el año 5 se compararon mediante curvas ROC. (B) La curva ROC demuestra la capacidad de la puntuación de riesgo para determinar el pronóstico en el año 1, el año 3 y el año 5. (C) Las curvas de Kaplan-Meier mostraron el tiempo de SG de los dos grupos de riesgo de pacientes dentro del conjunto de datos TARGET. . (D) El mapa de calor demostró los niveles de expresión de siete genes modelo de riesgo en pacientes. (E) Mutaciones de 7 genes modelo de riesgo en múltiples tumores. (F) Comparación de diferencias en los resultados de ESTIMACIONES entre grupos de alto y bajo riesgo. Los puntos rojos indicaron que los pacientes pertenecen al Grupo 1 y los puntos verdes indicaron que los pacientes pertenecen al Grupo 2. (G) Los diagramas de caja mostraron la expresión de ARNm de los puntos de control inmunológico en dos grupos de riesgo (*P <0,05; **P <0,01; ** *P<0,001). (H) Diagrama de caja de la distribución de la expresión de células inmunes entre los dos grupos de riesgo según lo calculado por el algoritmo ssGSEA (*P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001).

Los resultados del algoritmo ESTIMATE anterior se utilizaron para comparar grupos según el riesgo alto y bajo. Los resultados del análisis muestran una pureza tumoral más alta en el grupo de alto riesgo que en el grupo de bajo riesgo en el conjunto de datos GSE45547 (P <0,05). Relativamente, la puntuación estromal, la puntuación inmune y la puntuación ESTIMATE en el grupo de alto riesgo fueron más bajas que en el grupo de bajo riesgo (P <0,05) (Fig. 6F). En GSE49710, GSE73517, GSE120559 y E-MTAB-8248, la pureza del tumor, la puntuación inmune y la puntuación ESTIMATE tuvieron la misma variación en los grupos de alto riesgo versus bajo riesgo (Figura complementaria S6B-E). Además, comparamos la expresión de puntos de control inmunológico entre grupos de alto y bajo riesgo (Fig. 6G). En combinación con los resultados de ssGSEA, se puede concluir que el grupo de bajo riesgo tenía un mejor estado inmunológico (Fig. 6H).

La distribución de las puntuaciones de riesgo dentro del estado de MYCN, la edad y las etapas del INSS se exploró más a fondo en 1670 pacientes de los 5 conjuntos de datos de microarrays. Los resultados revelaron que los pacientes con estado de amplificación de MYCN, edad ≥18 meses y empeoramiento progresivo de la estadificación del INSS tenían puntuaciones de riesgo más altas (Fig. 7A). Los pacientes de E-MTAB-8248, GSE73517 y GSE120559 se dividieron en dos grupos, de alto riesgo y de bajo riesgo, según los valores de corte óptimos. Como se muestra en la Tabla 2, los reordenamientos de TERT fueron más comunes en el grupo de alto riesgo (P <0,05). Sin embargo, la positividad de los cuerpos de leucemia promielocítica asociada a ALT no fue estadísticamente diferente entre los dos grupos (P > 0,05). Después de eso, se exploró más a fondo la relación entre los grupos de riesgo y la inestabilidad cromosómica. Los resultados del análisis confirmaron que la eliminación de 1p y la ganancia de 17q diferían en los subgrupos de alto y bajo riesgo y que el grupo de alto riesgo tenía más probabilidades de tener estas aberraciones (P <0,05). Por el contrario, la eliminación de 11q no fue estadísticamente diferente entre los dos grupos (P <0,05) (Fig. 7B).

Comparación entre grupos de alto y bajo riesgo. (A) Comparación de puntuaciones de riesgo en estado MYCN, grupos de edad y etapas INSS. (B) El diagrama de Sankey mostró la distribución de anomalías cromosómicas en los dos grupos de riesgo. (C) El mapa de calor mostró los niveles de genes diferenciales entre los grupos de alto y bajo riesgo. (D) TOP 10 genes centrales identificados por el algoritmo MCC. (E) El gráfico de barras mostró los resultados del enriquecimiento de GSVA. El morado representó las principales vías enriquecidas en el grupo de alto riesgo y el verde representó las principales vías en el grupo de bajo riesgo. (F) Los 3 términos enriquecidos con GO más importantes en los grupos de alto y bajo riesgo. (G) Las 3 vías enriquecidas con KEGG más importantes en los grupos de alto y bajo riesgo.

Profundizamos más en los mecanismos estrechamente relacionados de agrupación clínica y de riesgo a través del análisis de varianza. Los pacientes con 1670 datos de microarrays se dividieron en grupos de alto y bajo riesgo según el modelo de riesgo para el análisis de diferencias. Se obtuvo un total de 314 genes diferenciales, incluidos 146 genes regulados negativamente y 168 genes regulados positivamente (alto riesgo versus bajo riesgo). Como se muestra en el mapa de calor, los genes diferenciales pudieron distinguir bien entre grupos de alto y bajo riesgo (Fig. 7C). El gráfico del volcán mostró los cinco genes principales en los genes diferenciales clasificados según su valor de P ajustado (Figura complementaria S7A). Luego construimos una red PPI utilizando la base de datos STRING (Figura complementaria S7B, C). Los 10 genes TOP basados ​​en el algoritmo MCC se demostraron además en genes regulados negativamente y genes regulados positivamente (Fig. 7D).

El análisis de enriquecimiento de genes diferenciales en la base de datos de Hallmark utilizando el algoritmo GSVA reveló diferencias significativas entre los dos grupos en numerosas vías (Fig. 7E). En el grupo de alto riesgo, las vías importantes fueron MYC Targets_V2, MYC Targets_V1, E2F Targets, respuesta de proteína desplegada, señalización Mtorc1, G2M chickpoint y reparación del ADN. En el grupo de bajo riesgo, la superficie apical, la respuesta UV_DN, la unión apical, el complemento, el metabolismo HEME y la miogénesis fueron las vías importantes. Un análisis adicional utilizando el método de enriquecimiento GSEA, pudimos encontrar que las vías de GO en el grupo de alto riesgo eran la segregación de cromátidas hermanas mitóticas, la segregación de cromosomas nucleares y la segregación de cromátidas hermanas. Los 3 términos PRINCIPALES del grupo de bajo riesgo fueron procesamiento y presentación de antígenos, procesamiento de antígenos y presentación de antígenos exógenos y procesamiento de antígenos y presentación de antígenos peptídicos exógenos (Fig. 7F). Los resultados de KEGG, por otro lado, mostraron que el grupo de alto riesgo estaba principalmente asociado estrechamente con las tres vías del ciclo celular, la replicación del ADN y el ribosoma (Fig. 7G). Las vías en el grupo de bajo riesgo se centraron en vías relacionadas con el sistema inmunológico, como la adicción a las anfetaminas, el linaje de células hematopoyéticas y la artritis reumatoide. Según los resultados del enriquecimiento, el peor pronóstico en el grupo de alto riesgo puede estar relacionado con esto.

Se empleó el algoritmo de bosque aleatorio para seleccionar los genes de la red neuronal. Utilizamos tanto la precisión de disminución media (MDA) como el Gini de disminución media (MDG) para obtener los 50 genes más importantes y tomamos la intersección de los dos como genes clave finales. A través del gráfico de tasa, error versus número de árboles, elegimos mtry = 6, ntree = 1200 como parámetro final del modelo (Figuras complementarias 8A, B). En nuestro modelo final ajustado, el valor fuera de bolsa (OOB) fue del 2,95 %. Como se muestra en la Fig. 8A, finalmente se identificaron 37 genes para la construcción de modelos de redes neuronales para pacientes con neuroblastoma. Por experimento, el número de capas ocultas fue 1, con un total de 20 neuronas ocultas y una tasa de aprendizaje = 0,1 como configuración final del modelo (Fig. 8B). Mientras tanto, la función de activación que elegimos fue "tanh". Completamos la capacitación con 643 pacientes del conjunto de datos GSE45547 y realizamos una validación externa en 493 pacientes de GSE49710 con buenos resultados (AUC = 0,966) (Fig. 8C).

Redes Neuronales y Análisis de Tratamiento. (A) Gráfico de clasificación de importancia de las variables según los MDA y los ODM. (B) Esquema de la estructura de la red neuronal. La capa roja exterior representa la capa de entrada, la azul del medio representa las 20 neuronas ocultas y la capa de salida es amarilla. (C) Las curvas ROC demuestran el rendimiento de clasificación de la red neuronal en el conjunto de datos GSE49710. (D) Evaluación de la probabilidad de supervivencia del paciente mediante nomogramas. (E) Niveles de expresión de genes diana de inmunoterapia. (F) Niveles de expresión del gen del punto de control del ciclo celular G1/S. (G) Niveles de expresión del gen del punto de control del ciclo celular G2/M. (H) Resultados del análisis de sensibilidad a los medicamentos de la base de datos GDSC. (I) Mapa de calor de correlación entre la puntuación de riesgo y la sensibilidad a los medicamentos.

Exploramos más a fondo si estos dos indicadores están relacionados con la supervivencia. La agrupación y la puntuación de riesgo se incluyeron en el análisis de regresión de Cox univariado, que reveló que tanto el Grupo 1 como la puntuación de riesgo más alta eran factores de riesgo que afectaban el pronóstico (Tabla 3). Los indicadores clínicos como la edad, si MYCN estaba amplificado y la estadificación del INSS se incluyeron además para el análisis de regresión multifactorial y los resultados revelaron que solo la puntuación de riesgo y la edad eran un factor de riesgo independiente para el pronóstico (Figura complementaria 8C). Para facilitar la evaluación del pronóstico, se construyeron nomogramas por edad y puntuación de riesgo. La probabilidad de supervivencia a 1, 3 y 5 años se predijo calculando el número de puntos (Fig. 8D).

Además, evaluamos la importancia de la agrupación y la puntuación de riesgo para guiar el tratamiento. La inmunoterapia como modalidad de tratamiento con gran potencial, comparamos la distribución de objetivos potencialmente utilizados en inmunoterapia entre los dos subgrupos agrupados. Podríamos encontrar diferentes niveles de expresión de objetivos de inmunoterapia en el Grupo 1 y el Grupo 2, lo que sugiere que diferentes grupos que utilizan diferente inmunoterapia pueden ser más pronósticos (Fig. 8E). La terapia dirigida al ciclo celular también es una modalidad de tratamiento importante. Fue interesante notar que los puntos de control del ciclo celular fueron significativamente diferentes entre los dos grupos (Fig. 8F,G). Las expresiones de CDK2, CDK4 y CDK6 fueron mayores en el Grupo 1 que en el Grupo 2, mientras que las expresiones de ATM fueron mayores en el Grupo 2 que en el Grupo 1. También analizamos la correlación con el IC50 del fármaco oncológico en la base de datos GDSC de GSCA. utilizando los genes que se utilizaron para la red neuronal (Fig. 8H). Según los resultados del análisis, creemos que el Grupo 2 puede ser más apropiado para los cuatro medicamentos RDEA119, Selumetinib, Trametinib y PD-0325901. Se descargaron datos de la base de datos CellMiner de líneas celulares NCI-60 y se realizaron análisis de sensibilidad entre puntuaciones de riesgo y medicamentos que se habían sometido a ensayos clínicos y aprobados por la FDA. Establecimos P <0,01 como nuestro índice de filtrado y mostramos los resultados con un mapa de calor (Fig. 8I). Según los resultados del análisis, se pudo encontrar que la mayoría de los medicamentos tenían una correlación negativa con las puntuaciones de riesgo.

Al ser un tumor sólido muy heterogéneo, el tratamiento individualizado del neuroblastoma para mejorar su pronóstico es un problema en esta etapa. Actualmente, el neuroblastoma se basa principalmente en el sistema de estratificación de riesgo del INRG para guiar el tratamiento de diferentes pacientes22. A pesar de esto, la SSC a 5 años para niños con neuroblastoma metastásico y de 18 meses o más es solo cercana al 50 %23. A medida que se estudian los inhibidores dirigidos al ciclo celular y los mecanismos relacionados con el ciclo celular ganan terreno en pacientes con neuroblastoma, el uso de genes relacionados con el ciclo celular es importante para identificar subtipos moleculares y encontrar objetivos terapéuticos o biomarcadores de pronóstico en pacientes con neuroblastoma.

Primero demostramos la viabilidad de tipificar a los pacientes según sus genes reduciendo la escala de 643 muestras utilizando el algoritmo tSNE basado en los niveles de expresión genética. Teniendo en cuenta la prometedora aplicación de la inmunoterapia, en nuestro estudio identificamos inicialmente 924 genes del ciclo celular relacionados con el sistema inmunológico utilizando el algoritmo WGCNA. Estos genes se correlacionaron negativamente con ESTIMATE Score y positivamente con Tumor Purity. Con base en los genes anteriores, clasificamos a los 1811 pacientes en dos grupos con distintas diferencias.

En términos de información clínica, los dos grupos tienen sus propias características significativas. En general, los indicadores clínicos en el Grupo 1 estaban más inclinados hacia un pronóstico desfavorable en relación con el Grupo 2. El porcentaje de pacientes en el Grupo 2 con una edad <18 meses fue mucho mayor que en el Grupo 1 (P <0,05). Para la distribución del estado de MYCN en los dos grupos, el Grupo 1 puede considerarse como un grupo MYCN amplificado y el Grupo 2 como un grupo MYCN no amplificado. Aunque 29 de 940 pacientes en el Grupo 2 tenían un estado amplificado de MYCN, lo que ilustra indirectamente la limitación de utilizar una clasificación de indicador biológico único en situaciones clínicas. Para la estadificación del INSS comúnmente utilizada, la etapa 4 representó el 60% del total en el Grupo 1, mientras que en el Grupo 2 esta proporción fue solo alrededor del 22%. El estudio demostró que cuanto mayor era el diagnóstico del niño (18 meses como valor de corte), el estado de MYCN amplificado y el estadio del INSS era estadio 4, siendo los tres marcadores de pronóstico desfavorable22,24. El grupo 1 también mostró más inestabilidad cromosómica, como lo demuestra el hecho de que los pacientes con deleción 1p y deleción 11q estaban más concentrados en el grupo 1 (P <0,05). El fenómeno de reordenamientos de TERT también fue más común en el Grupo 1 (P <0,05). Sin embargo, no hubo diferencias en la distribución de los cuerpos de leucemia promielocítica asociada a ALT y ganancia de 17q en los dos grupos (P > 0,05). Las curvas de Kaplan-Meier trazadas por el análisis de supervivencia también corroboraron que el tiempo de SG del Grupo 2 fue mejor que el del Grupo 1. Exploramos más a fondo la infiltración inmune entre los dos grupos. Realizamos una evaluación inmune dentro de cada uno de los seis conjuntos de datos utilizando los tres algoritmos CIBERSORT, ssGSEA y ESTIMATE. Combinando los resultados, podemos suponer que el Grupo 2 tiene un mejor estado inmunológico. Esto también puede explicar parcialmente por qué el grupo 2 tiene un mejor pronóstico.

Puntos de control inmunológico como base para la inmunoterapia, evaluamos la expresión de 24 puntos de control inmunológico entre dos grupos. Descubrimos que LAG3, CD276 y CD86 se expresaban altamente en el Grupo 1, mientras que la mayoría de los puntos de control inmunológico se expresaban altamente en el Grupo 2. Esto era inseparable de las características de la enfermedad. La amplificación de MYCN se correlacionó con un mayor número de células reguladoras LAG3+ tipo 1 (Tr1) en sangre periférica25. CD276(B7-H3) se expresa altamente en tumores y su expresión está restringida en tejidos normales, lo que es un objetivo terapéutico potencial26. En el experimento, las células T del receptor de antígeno quimérico contra CD276 pudieron superar la heterogeneidad del neuroblastoma27. La alta expresión de CD86 puede estar asociada con una mayor pureza tumoral en el Grupo 1. Las investigaciones muestran que CD86 indujo una respuesta inmune de células T en neuroblastoma in vitro y sirvió como una vacuna tumoral eficaz en el modelo de prevención de tumores28.

Los resultados del análisis de enriquecimiento de genes diferenciales entre los dos grupos revelaron aún más las diferencias en los mecanismos de las vías entre los dos grupos. Los genes altamente expresados ​​en el Grupo 1 se concentraron en vías relacionadas con el ciclo celular que involucran la segregación cromosómica, la unión de microtúbulos y la región cromosómica. El análisis de la información clínica anterior también mostró que el Grupo 1 presentaba más inestabilidad cromosómica. De manera similar, el Grupo 2 tiene un mejor estado inmunológico, como lo demuestran los resultados del enriquecimiento. La evidencia sugiere que el MHC-II específico de tumores se asocia con un buen pronóstico para los pacientes con cáncer, incluidos los tratados con inmunoterapia29.

Para evaluar mejor la situación individual de cada paciente, intentamos construir un modelo de riesgo utilizando DEG entre los dos grupos. Análisis más detallados mostraron que tenía mejor poder predictivo que los biomarcadores tradicionales. Primero obtuvimos 177 genes de DEG que estaban estrechamente asociados con la supervivencia utilizando el modelo de detección de Cox (P <0,01). Random Survival Forest (RSF), un algoritmo de supervivencia de aprendizaje automático, tiene muchas aplicaciones en biomedicina30,31. En este estudio, los valores VIMP de cada gen calculados por RSF se utilizaron para detectar genes estrechamente relacionados con la supervivencia. Los 50 genes con mayores valores de VIMP se incluyeron en el modelo de regresión de Lasso Cox finalmente se obtuvieron 7 genes (NMU, E2F3, UBE2S, DHFR, MIA, CHD5, FAXDC2) para la construcción del modelo. Entre estos, NMU, E2F3, UBE2S y DHFR pertenecen al Grupo 1 en relación con el Grupo 2 de genes altamente expresados. Mientras que MIA, CHD5 y FAXDC2 fueron genes de baja expresión.

Neuromedin U (NMU) debe su nombre a su potente efecto de contracción sobre los músculos del útero de rata32. Aunque las neuronas regulan los linfocitos congénitos tipo 2 a través de la neuromedina U33, la alta expresión de NMU se asocia con un mal pronóstico del cáncer34,35. El factor de transcripción 3 (E2F3) E2F interactúa directamente con la proteína del retinoblastoma para regular la expresión de genes que participan en el ciclo celular. Harold I Saavedra et al. encontraron que la sobreexpresión de E2F3 causa amplificación del centrosoma y mitosis descontrolada en varios estudios, lo que puede promover la inestabilidad cromosómica que conduce a tumores36,37. Se ha demostrado que la enzima conjugadora E2 S (UBE2S) de ubiquitina promueve el desarrollo del cáncer de ovario al promover la vía de señalización PI3K/AKT/mTOR para regular el ciclo celular38. Mientras tanto, UBE2S puede trabajar con TRIM28 en el núcleo para acelerar el ciclo celular mediante la ubiquitinación de p27 para desarrollar carcinoma hepatocelular39. En los últimos años, la dihidrofolato reductasa (DHFR), una enzima clave en el metabolismo de un carbono, ha sido bien reconocida como un objetivo para la terapia contra el cáncer40,41. Un coeficiente positivo para los cuatro genes mencionados anteriormente en el modelo de riesgo significa que cuanto mayor es el nivel de expresión genética, mayor riesgo corre el paciente.

MIA puede promover la separación de células de la matriz extracelular42. La proteína de unión al ADN 5 del cromodominio helicasa (CHD5) ha demostrado su papel único como un nuevo supresor de tumores en una variedad de cánceres43,44,45. El dominio de hidroxilasa de ácidos grasos que contiene 2 (FAXDC2), un miembro de la superfamilia de hidroxilasas de ácidos grasos, es un gen neo que mejora la maduración de los megacariocitos, lo que sugiere que puede tener un valor potencial como terapia para la diferenciación46. En conjunto, los siete genes modelo de riesgo incluyen tanto los que se han estudiado intensivamente como los que carecen de investigación, lo que sugiere el amplio valor potencial de investigación de los genes modelo de riesgo en el neuroblastoma. Al mismo tiempo, el análisis de la curva ROC indicó que los valores de AUC de la firma de OS en 1, 3 y 5 años fueron 0,9527, 0,87266 y 0,8792, lo que indica que nuestras firmas de pronóstico tienen una discriminación favorable. Además, el modelo de riesgo mostró una mejor capacidad de predicción en comparación con otros indicadores biológicos clínicos individuales.

Un análisis entre grupos de los dos grupos agrupados según puntuaciones de riesgo reveló diferencias claras en los niveles inmunológicos y la información clínica entre los dos grupos. Pudimos encontrar que LAG3, CD276 y CD86 estaban altamente expresados ​​en el grupo de alto riesgo. Combinando múltiples algoritmos de inmunización, podríamos suponer que el grupo de bajo riesgo tiene un mejor estado inmunológico. Los resultados del análisis clínico mostraron que los pacientes con estado de amplificación de MYCN, edad ≥ 18 meses y empeoramiento progresivo de la estadificación del INSS tenían puntuaciones de riesgo más altas, lo que demostró la coherencia del modelo de riesgo con el clínico. Los resultados del enriquecimiento de GSEA en el grupo de alto riesgo mostraron una fuerte correlación con la vía MYC. Los genes MYC son una clase de oncogenes de nucleoproteínas y, como factor de transcripción de acción amplia, MYC regula la diferenciación y proliferación celular a través de una variedad de mecanismos, incluida la amplificación transcripcional de genes diana47,48. Además, el grupo de alto riesgo está estrechamente asociado con vías de señalización como el ciclo celular y la segregación cromosómica. Las anomalías en estas vías pueden llevar a los pacientes a un mal pronóstico. Por el contrario, el grupo de bajo riesgo mostró una fuerte correlación con la inmunidad, lo que junto con los resultados del análisis inmunológico corroboraron el mejor estado inmunológico del grupo de bajo riesgo.

Dos subtipos moleculares de neuroblastoma clasificaron con éxito a los pacientes, y un modelo de riesgo basado en el análisis de las diferencias entre subtipos evaluó mejor cuantitativamente el estado de supervivencia de los pacientes. En esta etapa, los modelos de redes neuronales se han convertido en una poderosa herramienta para el aprendizaje automático. Para aplicar mejor los resultados del estudio en la clínica, utilizamos los resultados del análisis de varianza entre grupos para construir un clasificador de redes neuronales aplicable a pacientes con neuroblastoma. Una red neuronal basada en 37 genes construida en 643 pacientes quedó bien validada en la clasificación de 493 pacientes (AUC = 0,966).

El objetivo de los subtipos moleculares y los modelos de riesgo es ayudar a los pacientes a desarrollar planes de tratamiento individualizados y mejorar el pronóstico. Este estudio proporciona los resultados de análisis de sensibilidad para datos de múltiples fármacos. La terapia dirigida al ciclo celular constituye una herramienta terapéutica prometedora49. Con el éxito clínico de los inhibidores de CDK4/6, apuntar a componentes individuales del ciclo celular puede convertirse en una estrategia anticancerígena eficaz50. La distribución de los puntos de control del ciclo celular entre los dos grupos tenía sus propias características significativas. Para el grupo 1, con niveles de expresión más altos de CDK4, CDK6 y PLK1, podemos realizar el tratamiento aplicando frenos del ciclo celular. Los medicamentos en este segmento incluyen palbociclib, ribociclib y abemaciclib, que se dirigen a CD4/651, y BI 253652 y GSK46136453, que se dirigen a PLK1. Por el contrario, ATM se expresó altamente en el Grupo 2. Los pacientes pueden ser tratados con M3541 y AZD0156 acelerando el ciclo celular15.

Entre ellas, la inmunoterapia tiene un gran potencial para luchar contra el cáncer y poco a poco se está estudiando en profundidad la inmunoterapia para el neuroblastoma. GD2 es el antígeno diana más común para la inmunoterapia del neuroblastoma54,55. Aunque B4GALNT1, la enzima que cataliza el paso final de la síntesis de GD2, no difirió entre los dos grupos, ST3GAL5 y ST8SIA1, genes más arriba en la vía de síntesis, se expresaron más en el Grupo 1 que en el Grupo 2. Se ha demostrado esa regulación negativa de ST8SIA1 promueve la pérdida de GD2, lo que lleva a un cuello de botella en la síntesis y expresión de GD2, lo que resulta en la falla de los anticuerpos anti-GD256. Los resultados de los estudios sobre B7-H3 (CD276), ALK, GPC2 y PHOX2B como nuevos objetivos inmunoterapéuticos son muy prometedores para el tratamiento del neuroblastoma57,58. En este estudio, una comparación de la expresión de estos objetivos reveló una mayor expresión en el Grupo 1.

La heterogeneidad del neuroblastoma se manifiesta de varias maneras y esperamos poder clasificar diferentes categorías de pacientes y evaluar el perfil de riesgo de los pacientes a nivel genético. Según los resultados del estudio, se asigna al paciente un plan de tratamiento individualizado racional. El tratamiento individualizado es beneficioso para el pronóstico del paciente, al tiempo que aprovecha al máximo los recursos médicos y reduce la carga financiera del paciente. Aunque nuestro subtipo molecular y modelos de riesgo tuvieron un buen desempeño en la evaluación del desempeño clínico, el estado inmunológico y el pronóstico de supervivencia, se deben tener en cuenta ciertas limitaciones en este estudio. Todos nuestros resultados se obtuvieron analizando la información de los pacientes y los perfiles de expresión genética en bases de datos públicas, lo que puede verse influenciado por los datos que conducen a resultados sesgados. Sin embargo, compensamos esta deficiencia reuniendo a tantos pacientes como fuera posible.

Hemos desarrollado un modelo de red neuronal para clasificar a los pacientes con neuroblastoma y un modelo de riesgo para evaluar el estado pronóstico de los pacientes. Las diferencias mecanísticas intergrupales reveladas en el estudio son más beneficiosas para nuestra comprensión del neuroblastoma. Al mismo tiempo, se utilizarán los subtipos moleculares y el modelo de riesgo para ayudar a los médicos a elegir la mejor estrategia de tratamiento. Los 37 genes de clasificación de subtipos y los 7 genes modelo de riesgo obtenidos en este estudio proporcionan nuevas ideas para futuros experimentos.

El conjunto de genes de las vías de señalización relacionadas con el ciclo celular en GO y KEGG y las vías se descargaron a través de la base de datos de firmas moleculares59 (https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp) y se cotejaron para obtener 1865 genes relacionados con el ciclo celular para estudios adicionales. Los nombres comunes de los puntos de control inmunológico y del ciclo celular se recopilaron mediante la lectura de la literatura y se tradujeron para que coincidieran con los nombres de los genes en la matriz de expresión. Los datos sobre los niveles de expresión de genes diana en múltiples cánceres se obtuvieron de la plataforma de análisis interactivo de perfiles de expresión genética60 (GEPIA, //gepia.cancer-pku.cn/). Exploración y visualización de mutaciones en genes diana del cáncer multidimensional por The cBioPortal for Cancer Genomics61 (http://www.cbioportal.org).

Se realizó una búsqueda sistemática de datos transcriptómicos disponibles públicamente con anotaciones clínicas para neuroblastoma. En total, en nuestro estudio se incluyeron cinco conjuntos de datos de microarrays con información clínica y un conjunto de datos de secuenciación de ARN (RNA-seq) denominado TARGET-NBL que se descargó de Genomic Data Commons (//gdc.cancer.gov/). Los datos de expresión génica de microarrays que contenían GSE4554762, GSE49710, GSE7351763 y GSE12055964 se descargaron de Gene Expression Omnibus (GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) y E-MTAB-824865 se descargó de ArrayExpress ( https://www.ebi.ac.uk/biostudies/arrayexpress). Para los datos de microarrays descargados se normalizaron. Para el conjunto de datos TARGET, se descargaron el valor FPKM de expresión genética y el valor de recuento. En todos los conjuntos de datos, se eliminaron los pacientes sin estado MYCN. Utilizamos el algoritmo de incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en t (t-SNE) para reducir la escala de los datos de expresión multidimensional de los pacientes para observar la heterogeneidad del tumor. Para la posterior integración del conjunto de datos, adoptamos el método ComBat en lenguaje R con el paquete “sva”66 (versión 3.44.0) para eliminar el efecto por lotes entre los conjuntos de datos. El análisis de componentes principales se utilizó para evaluar si se eliminó el efecto del lote.

En el análisis se incluyeron los genes relacionados con el ciclo celular obtenidos de la recopilación anterior. El análisis de red de coexpresión de genes ponderados (WGCNA)67 se realizó utilizando el paquete “WGCNA” (versión 1.71) para construir una red de coexpresión sin escala e identificar un módulo genético que se asoció principalmente con los resultados de ESTIMATE. Los genes de ese módulo se identificaron como genes del ciclo celular relacionados con el sistema inmunológico (IRCCG).

Utilizamos el paquete “ConsensusClusterPlus”68 (versión 1.60.0) en R y la agrupación se seleccionó en función de los genes del ciclo celular relacionados con el sistema inmunológico identificados. El número máximo de grupos se estableció en 5. El número final de grupos se determinó mediante la matriz de consenso y la puntuación de consenso de los grupos (> 0,8). Las puntuaciones de consenso de grupo más altas indican una agrupación más sólida.

La pureza tumoral de las muestras, StromalScore, ImmuneScore y ESTIMATEScore se estimaron utilizando el paquete R “estimate”69 (versión 1.0.13). Se utilizó CIBERSORT70 para cuantificar la abundancia relativa de 22 especies de células inmunitarias en la muestra. Se empleó el algoritmo de análisis de enriquecimiento de conjunto de genes de muestra única (ssGSEA) para cuantificar la abundancia de 28 tipos de células inmunitarias en diferentes muestras.

Los pacientes se dividieron en diferentes grupos según el resultado del análisis de conglomerados o el resultado de la puntuación de riesgo. Se exploraron DEG de conjuntos de datos de microarrays entre dos grupos utilizando el paquete “limma”71 (versión 3.52.2). Se exploraron los DEG de conjuntos de datos de secuenciación entre dos grupos utilizando el paquete R “DESeq2” (versión 1.36.0). El límite de DEG se estableció en |log2 (Fold Change) |> 1 y el valor de P ajustado < 0,05. La visualización de los resultados del análisis de varianza se realizó en forma de gráficos de volcanes y mapas de calor.

El análisis de enriquecimiento funcional DEG, incluido el análisis de Gene Ontology (GO)72 y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)73, se llevó a cabo utilizando el paquete R “clusterProfiler”74 (versión 4.4.4). El valor de P ajustado <0,05 se consideró estadísticamente significativo. Se utilizó el paquete R “GSVA” (versión 1.44.2) para realizar el análisis de enriquecimiento en la base de datos de Hallmark y el valor de corte se estableció en 10. Para los resultados de enriquecimiento de GSEA, configuramos las métricas de detección como |Puntuación de enriquecimiento normalizado (NES )|> 1, valor P NOM < 0,05 y FDR (valor P ajustado) < 0,05.

La red PPI se realizó automáticamente mediante la herramienta de búsqueda para la recuperación de genes/proteínas que interactúan (versión 11.5; https://string-db.org/). Para la visualización se utilizó el software Cytoscape (versión 3.9.1). Además, se utilizó el complemento CytoHubba para identificar genes importantes en esta red como genes centrales. Utilizamos algoritmos de Centralidad máxima de camarilla (MCC) para calcular los 30 genes centrales principales.

En primer lugar, realizamos un análisis de factor único mediante el modelo de riesgos proporcionales en el conjunto de datos E-MTAB-8248 utilizando los resultados del análisis de varianza entre grupos. El análisis se logró a través de paquetes R de "supervivencia" (versión 3.3.1) y los genes con P <0,01 se seleccionaron como genes relacionados con el pronóstico. A continuación, utilizamos el modelo de bosque de supervivencia aleatorio (RSF) del paquete R “randomForestSRC” (versión 3.1.1) para filtrar aún más los genes candidatos que estaban estrechamente relacionados con la supervivencia. El algoritmo clasificó cada gen según su importancia y seleccionamos los 50 genes más importantes para incluirlos en el análisis posterior. Mediante el paquete R “glmnet” (versión 4.1-4), estos 50 genes se utilizaron como entrada del modelo de regresión de Cox del operador de selección y contracción mínima absoluta (LASSO) y, en última instancia, para descartar los genes significativos. Finalmente obtuvimos 7 genes para la construcción del modelo de puntuación de riesgo en nuestro análisis. Con base en los valores de expresión de los genes correspondientes de los pacientes y los coeficientes de Cox, podemos calcular la puntuación de riesgo para cada paciente según el algoritmo del producto interno de matrices. El cálculo se anunció públicamente de la siguiente manera:

Se aplicó el algoritmo de bosque aleatorio del paquete R “randomForest” (versión 4.7-1.1) para detectar los genes candidatos más importantes correlacionados con diferentes grupos en el conjunto de datos GSE45547. Con base en los resultados de clasificar la importancia de los genes, seleccionamos los genes que se cruzan en los 50 genes principales tanto de la precisión de disminución media (MDA) como del Gini de disminución media (MDG) como genes de entrada para construir la red neuronal. El paquete R “neuralnet” (versión: 1.44.2) se ha utilizado para desarrollar un modelo de aprendizaje profundo de los genes candidatos después de que los valores de expresión de los genes se estandarizaran a los valores máximo y más bajo. Configuramos capas ocultas y 20 neuronas ocultas en el conjunto de datos GSE45547 para entrenar el modelo. Para nuestro modelo de red neuronal construido en GSE49710 para validación externa.

El análisis de la correlación entre conjuntos de genes y fármacos se obtuvo de un análisis realizado en el sitio en línea GSCA75 (//bioinfo.life.hust.edu.cn/GSCA/#/). Esta plataforma de análisis integra datos sobre sensibilidad a fármacos y expresión genética de la base de datos GDSC. CellMiner (https://discover.nci.nih.gov/cellminer/home.do) es una base de datos diseñada para que la comunidad de investigación del cáncer facilite la integración y el estudio de datos moleculares y farmacológicos de las líneas celulares cancerosas NCI-60. Descargamos datos sobre los ensayos de medicamentos NCI-60 y los seleccionamos para su inclusión en nuestro estudio en busca de medicamentos que se habían sometido a ensayos clínicos y habían sido aprobados por la FDA. Después de recopilar los datos, utilizamos el análisis de correlación para evaluar la relación entre las puntuaciones de riesgo y la sensibilidad a los medicamentos.

Se utilizó el método Kaplan-Meier para dibujar curvas de supervivencia mediante el paquete "survminer" (versión 0.4.9). Se utilizó el análisis de un solo factor mediante el modelo de riesgos proporcionales para identificar los factores de pronóstico. Se utilizó el análisis multifactorial mediante el modelo de riesgos proporcionales para identificar factores pronósticos independientes. Se construyó un nomograma de pronóstico que incluye todos los factores de pronóstico independientes para predecir la SG de los pacientes con neuroblastoma mediante el paquete "rms" (versión 6.3-0).

Todo el procesamiento y análisis de datos se realizó en el software R (versión 4.2.1) de RStudio. Para comparar dos grupos de variables continuas, utilizamos pruebas t de Student independientes para calcular la significación estadística, y las diferencias entre variables no distribuidas normalmente se calcularon utilizando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. Utilizamos la prueba de chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher para analizar la significación estadística entre los dos conjuntos de variables categóricas. Todos los valores estadísticos de P fueron bilaterales y P <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

El estudio se basó en datos de fuente abierta de múltiples bases de datos. Se ha proporcionado aprobación ética a los pacientes involucrados en estas bases de datos. Por lo tanto, no existen problemas éticos con este artículo.

Los datos genéticos y clínicos utilizados en este estudio están disponibles en GEO (GSE45547: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE45547; GSE49710: https://www .ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE49710; GSE73517: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE73517; GSE120559 : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE120559), GDC (https://xenabrowser.net/datapages/?cohort=GDC%20TARGET-NBL&removeHub=https %3A%2F%2Fxena.treehouse.gi.ucsc.edu%3A443) y ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/biostudies/arrayexpress/studies/E-MTAB-8248?query=E-MTAB- 8248) bases de datos. Los genes relacionados con el ciclo celular se obtuvieron de MSigDB (KEGG: https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/human/geneset/KEGG_CELL_CYCLE.html; GOBP: https://www.gsea-msigdb.org /gsea/msigdb/human/geneset/GOBP_CELL_CYCLE.html). Los datos sobre los niveles de expresión de 7 genes modelo de riesgo en múltiples cánceres se obtuvieron de la plataforma GEPIA (//gepia.cancer-pku.cn/detail.php?clicktag=matrix). Mutaciones en 7 genes modelo de riesgo de cáncer multidimensional según el cBioPortal for Cancer Genomics (https://www.cbioportal.org/results/oncoprint?cancer_study_list=laml_tcga_pan_can_atlas_2018%2Cacc_tcga_pan_can_atlas_2018%2Cblca_tcga_pan_can_atlas_2018%2Clgg_tcga_ pan_can_atlas_2018%2Cbrca_tcga_pan_can_atlas_2018%2Ccesc_tcga_pan_can_atlas_2018%2Cchol_tcga_pan_can_atlas_2018%2Ccoadread_tcga_pan_can_atlas_2018%2Cdlbc_tcga_pan_can_atlas_2018% 2Cesca_tcga_pan_can_atlas_2018%2Cgbm_tcga_pan_can_atlas_2018%2Chnsc_tcga_pan_can_atlas_2018%2Ckich_tcga_pan_can_atlas_2018%2Ckirc_tcga_pan_can_atlas_2018%2Ckirp_tcga_pan_can_atlas _2018%2Clihc_tcga_pan_can_atlas_2018%2Cluad_tcga_pan_can_atlas_2018%2Clusc_tcga_pan_can_atlas_2018%2Cmeso_tcga_pan_can_atlas_2018%2Cov_tcga_pan_can_atlas_2018%2Cpaad_tcga_pan_can _atlas_2018%2Cpcpg_tcga_pan_can_atlas_2018%2Cprad_tcga_pan_can_atlas_2018%2Csarc_tcga_pan_can_atlas_2018%2Cskcm_tcga_pan_can_atlas_2018%2Cstad_tcga_pan_can_atlas_2018%2Ctgct_tc ga_pan_can_atlas_2018%2Cthym_tcga_pan_can_atlas_2018%2Cthca_tcga_pan_can_atlas_2018%2Cucs_tcga_pan_can_atlas_2018%2Cucec_tcga_pan_can_atlas_2018%2Cuvm_tcga_pan_can_atlas_2018&Z_SCORE _THRESHOLD=2.0&RPPA_SCORE_THRESHOLD=2.0 &profileFilter=mutaciones%2Cstructural_variants%2Cgistic&case_set_id=w_mut&gene_list=NMU%252C%2520E2F3%252C%2520UBE2S%252C%2520DHFR%252C%2520MIA%252C%2520CHD5%252C%2520FAXDC2&geneset_list= %20&tab_index=tab_visualize&Action=Enviar). Los datos utilizados para el análisis de fármacos se obtuvieron de GSCA (http://bioinfo.life.hust.edu.cn/GSCA/#/drug) y CellMiner (https://discover.nci.nih.gov/cellminer/loadDownload .do) bases de datos. Todos los demás datos que respaldan las conclusiones de este estudio se proporcionan en el artículo y sus archivos complementarios.

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Nos gustaría agradecer a las bases de datos públicas, incluidas GEO, GDC, ArrayExpress, MSigDB, GEPIA, cBioPortal, GSCA y CellMiner, por sus contribuciones a la medicina humana en las que comparten grandes volúmenes de datos. Gracias a los autores del paquete R por su contribución al avance de la bioinformática. Agradecemos el apoyo financiero del proyecto de tecnología y ciencia de la salud de Tianjin (ZC20014).

Universidad Médica de Tianjin, Tianjin, China

Enyang He, Bowen Shi, Ziyu Liu, Kaili Chang, Hailan Zhao, Wei Zhao y Hualei Cui

Hospital Infantil de Tianjin, Tianjin, China

Hualei Cui

Escuela de Graduados de la Universidad Médica de Tianjin, Tianjin, China

Enyang He, Bowen Shi, Ziyu Liu y Kaili Chang

Facultad de Ciencias Médicas Básicas de la Universidad Médica de Tianjin, Tianjin, China

Hailan Zhao y Wei Zhao

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Idea y diseño de investigación: EH y HC Adquisición de datos: EH, HZ y WZ Análisis de datos: EH, BS, ZL y KC Redacción de manuscritos: EH, BS y ZL Revisión: EH y HC

Correspondencia a Hualei Cui.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Él, E., Shi, B., Liu, Z. et al. Identificación de los subtipos moleculares y construcción de modelos de riesgo en neuroblastoma. Representante científico 13, 11790 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35401-3

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Recibido: 23 de diciembre de 2022

Aceptado: 17 de mayo de 2023

Publicado: 21 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35401-3

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